【CEM】通过微波辅助环闭合复分解反应实现碳氢键合肽的自动化合成

一、摘要

利用Liberty Blue™自动化微波多肽合成仪，通过微波增强的固相多肽合成（SPPS）技术，可以快速合成高纯度的烃键合多肽。在不到4小时内，我们成功合成了一种促凋亡BID键合多肽衍生物，即BID SAHB（BCL-2结构域的稳定α螺旋）1，其纯度达到了80%。同样，一种促凋亡的BIM键合多肽，BIM SAHB2，也在不到4小时的时间内制备完成，纯度同样为80%。

二、介绍

肽键合是稳定α-螺旋的一种有效策略，而α-螺旋是决定各种肽和蛋白质生物活性的重要结构单元。³特别是碳氢键合技术已经成为一种强大的方法来稳定α-螺旋，已经产生了多个具有更高靶标亲和力和显著增强抗蛋白酶能力的肽例子。⁴此外，一些碳氢键合的肽被证明比其未键合的类似物具有更大的细胞通透性和体内活性^2,5，这进一步激发了将α-螺旋肽用于治疗应用的努力。⁶

碳氢键合的肽可以通过使用侧链末端带有烯烃的氨基酸进行SPPS（固相多肽合成）制备，例如Fmoc-(S)-2-(4-戊烯基)丙氨酸-OH（图1左）⁷。在合成前缀键合的肽后，可以通过环闭合复分解反应（RCM）使用Grubbs催化剂™第一代（图1右）⁷制备键合变体。传统的室温合成键合肽通常是一个耗时的过程，20个氨基酸长度的肽需要超过30小时的合成时间。将微波能量应用于碳氢键合肽的合成可以更有效地耦合，从而提高合成时间和高纯度（CarboMAX）。⁸

图1：（左）Fmoc-(S)-2-(4-戊烯基)丙氨酸-OH；（右）Grubbs催化剂第一代

三、材料与方法

试剂

以下Fmoc氨基酸购自CEM公司（马修斯，北卡罗来纳州），并含有指示的侧链保护基团：Arg(Pbf), Asn(Trt), Asp(OMpe), Glu(OtBu), Gln(Trt), His(Boc), Ser(tBu), Trp(Boc)和Tyr(tBu)。Rink Amide ProTide™LL树脂也购自CEM公司。Grubbs催化剂^TM第一代、Fmoc-(S)-2-(4-戊烯基)丙氨酸-OH、N,N’-二异丙基碳二亚胺（DIC）、哌啶、三氟乙酉夋（TFA）、3,6-二氧杂-1,8-辛二硫醇（DODT）、三异丙基硅烷（TIS）和醋酸酐（Ac₂O）购自Sigma-Aldrich（圣路易斯，密苏里州）。1,2-二氯乙烷（DCE）购自Alfa Aesar（哈弗希尔，马萨诸塞州）。二氯甲烷（DCM）、N,N-二甲基甲酰胺（DMF）、无水乙酉迷（Et₂O）、醋酸、高效液相色谱级水和乙腈购自VWR（西切斯特，宾夕法尼亚州）。LC-MS级水（H₂O）和LC-MS级乙腈（MeCN）购自Fisher Scientific（沃尔瑟姆，马萨诸塞州）。

肽合成：BID SAHB, Ac-EDIIRNIARHLA(S5)VGD(S5)LDRSIW-NH₂

该肽（图2）是在0.05mmol规模上使用CEM Liberty Blue自动化微波多肽合成仪制备的，使用了0.263克Rink Amide ProTide LL树脂（0.19meq/g替代度）。Fmoc脱保护使用20%哌啶和0.1M Oxyma Pure在DMF中进行。耦合反应使用5倍过量的0.2M Fmoc-AA与0.5M DIC和0.5M Oxyma Pure在DMF中进行（CarboMAX）。⁸Fmoc-(S)-2-(4-戊烯基)丙氨酸-OH用于S5。乙酰化封端在E的Fmoc脱保护后使用10% Ac₂O在DMF中进行。环闭合复分解键合反应使用10mM Grubbs催化剂第一代（58mg）在DCE（7mL）中的溶液。切割使用CEM Razor™高通量多肽切割系统进行，切割液为92.5:2.5:2.5 TFA/H₂O/TIS/DODT。切割后，用Et₂O沉淀肽并过夜冻干。

图2：碳氢键合的BID SAHB

肽合成：BIM SAHB, Ac-IWIAQELR(S5)IGD(S5)FNAYYARR-NH₂

该肽（图3）是在0.05mmol规模上使用CEM Liberty Blue自动化微波多肽合成仪制备的，使用了0.263克Rink Amide ProTide LL树脂（0.19meq/g替代度）。Fmoc脱保护使用20%哌啶和0.1M Oxyma Pure在DMF中进行。耦合反应使用5倍过量的0.2M Fmoc-AA与0.5M DIC和0.5M Oxyma Pure在DMF中进行（CarboMAX）。⁸Fmoc-(S)-2-(4-戊烯基)丙氨酸-OH用于S5。乙酰化封端在I的Fmoc脱保护后使用10% Ac₂O在DMF中进行。环闭合复分解键合反应使用10mM Grubbs催化剂第一代（58mg）在DCE（7mL）中的溶液。切割使用CEM Razor™高通量多肽切割系统进行，切割液为TFA/H₂O/TIS/DODT。切割后，用Et₂O沉淀肽并过夜冻干。

图3：碳氢键合的BIM SAHB

肽分析

肽在配备PDA检测器的Waters Acquity UPLC系统上进行分析，该系统装有Acquity UPLC BEH C8柱（1.7微米和2.1 x 100毫米）。UPLC系统连接到Waters 3100单四极杆质谱仪用于结构测定。峰分析通过Waters MassLynx软件完成。分离采用梯度洗脱，流动相为0.05% TFA在（i）H₂O和（ii）MeCN中的混合物。

四、结果

使用Liberty Blue自动化微波多肽合成仪进行微波增强的固相肽合成（SPPS），成功制备了BID SAHB目标肽，纯度达到80%（图4）。

图4：BID SAHB的UPLC色谱图

使用Liberty Blue自动化微波多肽合成仪进行微波增强的固相肽合成（SPPS），成功制备了BIM SAHB目标肽，纯度达到80%（图5）。

图5：BIM SAHB的UPLC色谱图

五、结论

使用微波增强的固相肽合成（SPPS）可以快速高效地合成碳氢键合肽。传统的室温下BID SAHB肽的合成需要超过35小时的合成时间来生成未键合的肽，并且还需要额外的3-6小时进行键合。⁷通过微波增强的SPPS，在不到4小时内即可合成纯度为80%的键合肽。传统的BIM SAHB肽的室温合成需要33小时的人工操作时间，并且还需要额外的3-6小时进行键合。⁷另一方面，微波增强的SPPS在不到4小时内即可提供纯度为80%的键合肽。